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城鎮(zhèn)污水廠是生活污水和工業(yè)廢水排入自然水體前至關(guān)重要的末端處理環(huán)節(jié)，特別是在一些飲用水水源地上游地區(qū)，對(duì)氮排放的要求更加嚴(yán)格。硝化過(guò)程是城鎮(zhèn)污水廠生物脫氮的第一步，硝化菌是此過(guò)程的決定性微生物。當(dāng)城鎮(zhèn)污水廠硝化功能崩潰時(shí)，硝化菌的活性會(huì)受到抑制，導(dǎo)致出水氨氮升高。目前一般采用降低污泥負(fù)荷、延長(zhǎng)污泥齡等措施進(jìn)行恢復(fù)，但耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)3~6個(gè)月，恢復(fù)期內(nèi)污水廠出水水質(zhì)不能穩(wěn)定達(dá)標(biāo)。

載體富集硝化菌能夠使硝化菌群高度集中，并且載體中的硝化菌可以形成生物膜，因此其更加穩(wěn)定、不易流失。筆者通過(guò)考察載體富集硝化菌群的反應(yīng)比速率、活性比值、掛膜量和微生物多樣性等指標(biāo)，篩選最優(yōu)載體，可為縮短污水廠恢復(fù)周期、提高污水廠抗沖擊能力提供參考。

1、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)條件

本實(shí)驗(yàn)以MBBR型、纖維球、細(xì)菌球三種材料為載體（載體參數(shù)見(jiàn)表1），分別放入不銹鋼網(wǎng)孔焊筒容器中，在河北省某縣城污水處理廠的曝氣池進(jìn)行掛膜，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保證容器懸浮于生化池內(nèi)，防止積泥。實(shí)驗(yàn)總時(shí)長(zhǎng)為58d。該生化池采用百樂(lè)克（BIOLAK）工藝，進(jìn)水氨氮為15~30mg/L，出水氨氮為0.78~1.42mg/L；主要運(yùn)行參數(shù)：污泥濃度為3785~5773mg/L，好氧池溶解氧濃度為2~4mg/L，溫度為21~27℃。

1.2 微生物活性分析實(shí)驗(yàn)

每周進(jìn)行一次微生物活性（反應(yīng)比速率）實(shí)驗(yàn)，分別取1L（填充體積）載體和活性污泥放入燒杯中，再加入污水廠穩(wěn)定池出水至3L。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)加入400mg/L的碳酸氫鈉、30mg/L的碳酸氫銨和8mg/L的亞硝酸鈉作為反應(yīng)基質(zhì)，以硫酸/碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值為6~8。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用曝氣頭和空氣泵進(jìn)行曝氣，使溶解氧≥3mg/L，每1h取樣一次，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后測(cè)定氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮濃度，并計(jì)算氨氧化菌（AOB）和亞硝酸鹽氧化菌（NOB）的容積速率和反應(yīng)比速率。

1.3 分析項(xiàng)目及方法

NH3-N采用納氏試劑法測(cè)定，NO3--N采用紫外分光光度法測(cè)定，NO2--N采用分光光度法測(cè)定。活性污泥和載體中微生物的多樣性采用Illumina高通量測(cè)序方法進(jìn)行測(cè)定。活性污泥和載體的MLSS和MLVSS均采用國(guó)標(biāo)法測(cè)定。

1.4 微生物種群及多樣性分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別從活性污泥、MBBR型載體、細(xì)菌球載體、纖維球載體中提取污泥或生物膜，以8000r/min離心10min，將濃縮的污泥或生物膜保存在-20℃的冰箱中進(jìn)行DNA樣品分析。

使用PowerSoilDNA提取包從樣品中提取微生物總DNA。采用分光光度計(jì)測(cè)定230nm、260nm和280nm處的吸光度值，然后計(jì)算260nm/280nm和260nm/230nm的吸光度比值來(lái)評(píng)估DNA，并且在-80℃下保存DNA。采用通用引物（正向引物：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；反向引物：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）與銜接子序列和條形碼序列進(jìn)行組合擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因的V3-V4區(qū)域。

PCR產(chǎn)物通過(guò)VAHTSTMDNACleanBeads進(jìn)行純化，然后在反應(yīng)中進(jìn)行第二輪PCR，最后用Quant-it?dsDNAHS試劑對(duì)所有PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，并將其聚合在一起，對(duì)純化的混合樣本進(jìn)行細(xì)菌16SrRNA基因的高通量測(cè)序分析。

2、結(jié)果與討論

2.1 不同載體對(duì)AOB和NOB活性的影響

不同載體對(duì)AOB和NOB活性的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，MBBR型、纖維球、細(xì)菌球三種載體隨著掛膜時(shí)間的延長(zhǎng)，AOB的反應(yīng)比速率在35d左右達(dá)到峰值，NOB的反應(yīng)比速率在28d左右達(dá)到峰值，而后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這是由于載體結(jié)構(gòu)相對(duì)固化，生物膜不斷生長(zhǎng)、老化且不易脫落，而新的生物膜難以形成。掛膜35d時(shí)，MBBR型、纖維球、細(xì)菌球載體的AOB反應(yīng)比速率分別為1.93、2.18、2.72mg/（gVSS·h），活性污泥中AOB的比速率為1.91mg/（gVSS·h），三種載體分別比活性污泥提高了0.1%、14.1%、42.41%，說(shuō)明載體比活性污泥具有更高的AOB比速率，其中細(xì)菌球掛膜載體的AOB比速率最高。理論上，按50%的填充體積投加實(shí)驗(yàn)掛膜載體，其AOB反應(yīng)比速率可分別提高50.5%、57.1%、71.2%。

掛膜28d時(shí)，MBBR型、纖維球、細(xì)菌球的NOB反應(yīng)比速率分別為1.00、1.46、1.68mg/（gVSS·h），與AOB一樣，細(xì)菌球載體的NOB反應(yīng)比速率在三種載體中最高。經(jīng)計(jì)算活性污泥中NOB的反應(yīng)比速率為1.88mg/（gVSS·h）。載體上NOB的反應(yīng)比速率均比活性污泥的低，主要是由于載體具有一定程度的選擇性，且在生物膜中NOB處于更靠近載體的空間，溶解氧擴(kuò)散至NOB要通過(guò)外層的AOB，因此導(dǎo)致生物膜中NOB的活性比沒(méi)有傳質(zhì)阻礙的活性污泥絮體中的低。另外，可能是由于該污水處理廠生化池中溶解氧有一定的波動(dòng)，而NOB對(duì)環(huán)境較為敏感，其生長(zhǎng)受到抑制。理論上，按50%的填充體積投加實(shí)驗(yàn)掛膜載體，其N(xiāo)OB的反應(yīng)比速率可分別提高26.6%、38.8%、44.7%。

掛膜35d時(shí)，MBBR型、纖維球、細(xì)菌球載體中AOB的容積速率分別為0.46、0.75、1.18mg/（L·h），可見(jiàn)細(xì)菌球富集AOB的效果更好。掛膜28d時(shí)，MBBR型、纖維球、細(xì)菌球載體中NOB的容積速率分別為0.22、0.88、0.55mg/（L·h），纖維球的NOB富集量最多。由于三種載體的掛膜生物量均比活性污泥低，因此，實(shí)驗(yàn)期間三種填料的容積速率均比活性污泥低。

2.2 不同載體對(duì)AOB/NOB值的影響

AOB作用于生物脫氮中硝化反應(yīng)的第一步，是脫氮效率的限制因素，而通常系統(tǒng)中的NOB不論是在數(shù)量上，還是多樣性上都比AOB更好。因此，系統(tǒng)中AOB與NOB的比值越高，證明AOB活性越好，脫氮率越高。經(jīng)計(jì)算，活性污泥AOB/NOB值接近于1，這與王正富和卞偉等的研究一致。關(guān)于載體生物膜，王榮昌等和Noda等研究發(fā)現(xiàn)，生物膜厚度為80~120μm時(shí)，AOB和NOB主要分布在生物膜表面25~35μm范圍內(nèi)，可以更好地利用水體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。同時(shí)，當(dāng)AOB/NOB值大于2時(shí)，可以較好地提高系統(tǒng)中的好氧速率，有利于系統(tǒng)中硝化反應(yīng)的進(jìn)行；MBBR型、纖維球、細(xì)菌球載體AOB/NOB值分別為1.71、1.70、2.10，可見(jiàn)三種載體均可大幅度提高系統(tǒng)的硝化反應(yīng)比速率。通常情況下，生化池中無(wú)法監(jiān)測(cè)到亞硝酸鹽的積累，由此說(shuō)明在活性污泥系統(tǒng)中NOB的活性大于AOB的活性，因此可以驗(yàn)證AOB確實(shí)是系統(tǒng)中的限制性因素，適當(dāng)提高系統(tǒng)中AOB的比例有助于提高硝化菌的處理效率。綜上可知，細(xì)菌球掛膜載體有較高的AOB/NOB值，因此在硝化反應(yīng)中更有優(yōu)勢(shì)。

2.3 時(shí)間對(duì)掛膜量的影響

時(shí)間對(duì)掛膜量的影響見(jiàn)圖2。可知，隨著掛膜時(shí)間的延長(zhǎng)，單位填充體積載體的掛膜量逐漸增多。0~35d時(shí)，纖維球、細(xì)菌球掛膜量先增加后趨于穩(wěn)定，掛膜量分別為1.87、2.38g/L；而該階段MBBR型載體的掛膜量處于穩(wěn)步增長(zhǎng)階段。結(jié)合圖1中AOB和NOB反應(yīng)比速率先升后降可知，纖維球、細(xì)菌球掛膜量的增長(zhǎng)趨勢(shì)減緩可以進(jìn)一步驗(yàn)證載體在系統(tǒng)中無(wú)法形成流態(tài)，造成生物膜產(chǎn)生一定程度的老化且不易脫落，新的生物膜難以形成；而MBBR型載體生物膜中AOB和NOB的反應(yīng)比速率均較低，其掛膜量雖然在增長(zhǎng)，但硝化菌群的反應(yīng)比速率并未明顯提高。35~56d時(shí)，三種載體的掛膜量雖有不同程度的增加，但結(jié)合圖1的反應(yīng)比速率可知，繼續(xù)增加的生物膜無(wú)法進(jìn)一步提高硝化反應(yīng)效率。該掛膜階段說(shuō)明細(xì)菌球載體的生物膜最有效。

2.4 微生物種類(lèi)及數(shù)量分析

通過(guò)高通量測(cè)序結(jié)果可知，活性污泥和不同載體的多樣性指數(shù)有一定的差別（見(jiàn)表2）。三種載體的Shannon指數(shù)均高于活性污泥，表明載體中微生物的物種多樣性更高，群落的復(fù)雜程度更高。細(xì)菌球的物種多樣性最高，可由最高的Shannon指數(shù)和最低的Simpson指數(shù)證明。因此，當(dāng)向污水廠生化系統(tǒng)中投加細(xì)菌球載體時(shí)，可以明顯增加系統(tǒng)的生物多樣性，主要原因是載體的污泥齡更長(zhǎng)（一般30d左右），可為微生物的進(jìn)化提供時(shí)間和空間。

通過(guò)高通量測(cè)序，在科水平上對(duì)活性污泥及不同載體生物膜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2種硝化螺旋菌科，即Nitrosomonadaceae、Nitrospiraceae。Nitrosomonadaceae作為主要的AOB菌科，其在活性污泥、MBBR型、細(xì)菌球、纖維球上的相對(duì)豐度分別為1.39%、2.23%、2.53%、1.92%；Nitrospiraceae作為主要的NOB菌科，在活性污泥、細(xì)菌球、MBBR型、纖維球上的相對(duì)豐度分別為2.08%、4.87%、2.97%、3.10%。屬水平上的分析表明，Nitrospira作為最主要的硝化菌屬，在活性污泥、MBBR型載體、細(xì)菌球載體、纖維球載體中的相對(duì)豐度分別為2.47%、4.07%、2.83%、3.02%，表明載體在掛膜過(guò)程中富集了更多的硝化菌，且在三種載體中MBBR型載體上的Nitrospira相對(duì)豐度最高（見(jiàn)圖3）。

同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)部分細(xì)菌兼具AOB和NOB作用，可以將底物由氨氮直接轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，適宜生存在低氨氮環(huán)境中，可作為出水指示性微生物。具備該功能的微生物一部分隸屬于Nitrospira屬，但是與龐大的Nitrospira屬相比，已發(fā)現(xiàn)的硝化菌種類(lèi)較少，因此出于簡(jiǎn)化模型考慮，此處假設(shè)該菌屬為NOB的一種，且在活性污泥和生物膜中均為優(yōu)勢(shì)菌種。在活性污泥和載體生物膜中的優(yōu)勢(shì)AOB菌種為Nitrosomonas，且在載體中的相對(duì)豐度較高，因此可以得出，載體在選擇性富集硝化菌方面起到了良好的作用。

在污水廠生化池馴化掛膜情況下，細(xì)菌球載體相對(duì)更易于硝化菌群的附著，細(xì)菌球載體和活性污泥中硝化菌群總占比分別為7.40%和3.47%，富集效率高達(dá)2.1倍。因此通過(guò)以上結(jié)果可以得出，載體可以選擇性地有效富集硝化菌群，且細(xì)菌球載體的富集效率最高。

3、結(jié)論

①細(xì)菌球載體對(duì)硝化菌群富集效果最好，最佳掛膜時(shí)間在30d左右。

②細(xì)菌球載體的AOB/NOB值最高可達(dá)2.10，相比活性污泥的AOB/NOB值（1左右），載體選擇性富集了更多的AOB。

③細(xì)菌球掛膜載體的AOB和NOB反應(yīng)比速率分別達(dá)到2.72和1.68mg/（gVSS·h），作為限制性因素的AOB比活性污泥提高了42.41%。理論上，按50%的填充體積投加細(xì)菌球掛膜載體時(shí)，活性污泥中AOB的反應(yīng)比速率可提高71.2%，NOB的反應(yīng)比速率可提高44.7%。

④高通量測(cè)序結(jié)果表明，細(xì)菌球載體中硝化菌數(shù)量占比高達(dá)7.40%，與活性污泥中的硝化菌含量相比富集效率高達(dá)2.1倍。相比活性污泥，載體生物膜中的菌群更加多樣化，因此增加了系統(tǒng)的穩(wěn)定性和抗沖擊性。