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厭氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation，ANAMMOX)是一種環(huán)境友好的新型生物脫氮工藝，有效解決了傳統(tǒng)生物脫氮工藝碳源需求大和能耗成本高的問題，被認為是21世紀最具發(fā)展前景的生物脫氮工藝之一。然而，作為ANAMMOX工藝的關鍵功能菌，厭氧氨氧化菌生長緩慢，生長速率遠低于其他脫氮細菌，且對溫度、pH和DO等外界環(huán)境的要求十分苛刻，使其不得不面臨工藝啟動困難，菌種來源匱乏等問題，極大地限制了厭氧氨氧化成為污水處理的主流工藝。ANAMMOX污泥的儲存可有效保留厭氧氨氧化菌(AnAOB)，活化后的ANAMMOX儲存污泥是厭氧氨氧化工藝可靠的菌種來源之一。因此，在室溫條件下對厭氧氨氧化污泥進行較長時間的儲存，并研究能在短期內使其脫氮活性快速恢復的方法，對厭氧氨氧化工藝的工程化應用具有重要意義。

目前厭氧氨氧化污泥的活性恢復主要面臨著2個方面的問題：一是儲存時間越長，污泥的脫氮性能越低，需要的恢復時間越長。黃佳路等研究發(fā)現ANAMMOX污泥的比厭氧氨氧化活性隨儲存時間呈近乎線性下降(r2為0.978)。二是厭氧氨氧化菌在恢復過程中容易被N2氣泡攜帶而從反應器中洗脫，導致生物質的漂浮。有研究表明，AnAOB分泌的胞外聚合物可以使其緊密附著在生物填料上，從而有效緩解反應器內部的細胞沖刷現象，增強系統(tǒng)的生態(tài)穩(wěn)定性和機械穩(wěn)定性。然而，關于填料對長期儲存后的ANAMMOX污泥活性恢復的影響研究較為稀缺。

本研究將活性良好的厭氧氨氧化污泥置于室溫(15~30℃)條件下進行為期9個月的長期儲存，儲存過程中不提供任何微生物生長所需的基質。通過比較添加不同填料的厭氧氨氧化反應器的污泥顏色變化、脫氮效果和微生物群落特征等情況，探究長期室溫儲存后的厭氧氨氧化污泥的活性恢復能力，分析填料在恢復過程中發(fā)揮的作用，以期為長期室溫儲存后的ANAMMOX污泥的活性快速恢復提供理論依據和技術指導。

1、材料與方法

1.1 接種污泥

儲存前的厭氧氨氧化污泥取自某工廠厭氧氨氧化脫氮裝置，污泥濃度2250mg·L-1，呈紅褐色，有良好的沉降性能和厭氧氨氧化活性。將該厭氧氨氧化污泥在室溫條件下避光密封儲存9個月，期間室內環(huán)境最高溫度為30℃，最低溫度為15℃。

污泥活性恢復前，用氨氮和亞硝態(tài)氮濃度均為10mg·L-1的培養(yǎng)液清洗3遍，接著將污泥粉碎，使其粒徑保持在1mm左右，增大其與培養(yǎng)液的接觸面積，強化污泥恢復過程中的生物反應。

1.2 實驗用水

本實驗采用人工配水，由(NH4)2SO4和NaNO2提供氮源，通過0.1mol·L-1 HCl控制pH在7.5~8.0.其他配水組分包括： ρ(NaHCO3)1250mg·L-1， ρ(MgSO4 ·7H2 O)300mg·L-1， ρ(KH2PO4)10mg·L-1， ρ(CaCl2)5.6mg·L-1，微量元素Ⅰ1mL·L-1，微量元素Ⅱ1mL·L-1.微量元素Ⅰ成分： ρ(EDTA)5000mg·L-1， ρ(FeSO4 ·7H2 O)5000mg·L-1;微量元素Ⅱ成分： ρ(EDTA)5000mg·L-1， ρ(MnCl2 ·4H2 O)990mg·L-1， ρ(CuSO4 ·5H2 O)250mg·L-1， ρ(ZnSO4 ·7H2 O)430mg·L-1， ρ(CoCl2 ·6H2 O)240mg·L-1， ρ(Na2MoO4 ·2H2 O)220mg·L-1， ρ(NiCl2 ·6H2 O)190mg·L-1， ρ(H3BO4)14mg·L-1.本實驗在進水中額外投加了ρ(Ca2+)0.03mmol·L-1，以促進厭氧氨氧化菌分泌胞外聚合物，幫助受損的厭氧氨氧化菌群附著在填料上并完成再生。考慮到氮氣脫氧需要配置減壓閥、液氮鋼瓶等相對復雜的曝氣設備，每次脫氧需耗時20min左右，而采用無水Na2SO3進行化學脫氧只需攪拌15s即可達到目標脫氧效果，且化學脫氧的成本遠低于氮氣脫氧，故本研究采用了操作更便捷、成本更低、脫氧更快的無水亞硫酸鈉還原脫氧法。本實驗投加的無水Na2SO3濃度約為0.1g·L-1，結合相關文獻，該SO42-濃度對微生物和基質濃度幾乎不產生影響，反應式見式(1)。

活性恢復期間根據污泥脫氮效果，對進水濃度進行了3次提升，詳見表1.

1.3 實驗裝置

本實驗裝置如圖1所示，反應器采用有機玻璃材質，有效容積1.0L，其中，每組反應器污泥投加量為0.3L，水體體積為0.4L，容積交換率50%，水力停留時間24h。裝置接口處均采用硅膠密封，以保證反應器內的厭氧環(huán)境。通過恒溫水浴振蕩器將裝置溫度控制在(35±1)℃，并以120r·min-1的頻率振蕩，使反應器內部培養(yǎng)液分布均勻。反應器外部用錫紙包裹遮光，防止藻類滋生。

如圖2所示，R2和R3反應器內分別填充彗星纖維填料(比表面積1100m2 ·m-3)和K3填料(比表面積約500m2 ·m-3)作為生物載體。

1.4 檢測項目與方法

NH4+-N、NO2--N和NO3--N濃度分別采用納氏試劑分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法測定，總無機氮TIN=[NH4+-N]+[NO2--N]+[NO3--N]。污泥濃度采用重量法測定，pH采用便攜式pH計檢測。

采用16SrRNA高通量測序技術來研究厭氧氨氧化系統(tǒng)中的微生物多樣性和群落結構。樣品取自運行第35d的3組反應器中的ANAMMOX污泥。

2、結果與討論

2.1 恢復過程中污泥的顏色變化

紅色是厭氧氨氧化菌(AnAOB)最顯著的特征，活性恢復過程中污泥的顏色變化見圖3.厭氧氨氧化污泥在未補充基質的情況下經過9個月的室溫保存，結構變得細碎，顏色發(fā)黑，散發(fā)臭味，這是由于在無基質添加的厭氧氨氧化污泥儲存過程中，AnAOB的胞內血紅素不斷衰減，同時由于菌體死亡水解，黑色硫化物的含量增加，最終逐漸覆蓋住污泥原本的紅色外觀，使污泥呈現黑色。經過42d的運行，AnAOB利用包括細胞色素c在內的多種蛋白質，完成菌體的生長、繁殖和代謝，厭氧氨氧化活性明顯提高。R2和R3反應器中可看到明顯的紅色顆粒污泥以及紅色生物膜，而R1反應器中的污泥總體顏色較恢復前雖然發(fā)生了變化，但幾乎看不到紅色顆粒污泥。Kang等的研究發(fā)現色度與比厭氧氨氧化活性顯著相關(r=0.940)，可以作為一種直觀的厭氧氨氧化活性指標。在本研究中，R2和R3反應器內的厭氧氨氧化活性顯然更高。

2.2 活性恢復過程中污泥的脫氮效果

2.2.1 啟動階段

本研究采用低氮進水和較長水力停留時間來啟動恢復實驗，待污泥脫氮性能逐漸恢復后，再逐步提高進水基質濃度，提升系統(tǒng)脫氮負荷。各階段污泥脫氮效果和化學計量比變化見圖4.根據ANAMMOX反應的化學方程式，本實驗各階段進水NH4+-N和NO2--N的化學計量比均采用1∶1.32.

第Ⅰ階段(1~10d)，進水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分別為50mg·L-1和66mg·L-1，水力停留時間HRT設定為24h。3組反應器經過短暫的適應之后脫氮性能均有提升，但處理效果不夠穩(wěn)定，化學計量比波動較大。由圖4(d)可知，R2和R3反應器的氮去除效果明顯優(yōu)于R1反應器。Zhang等的研究發(fā)現填料可以為微生物生長提供不同的生態(tài)位，實現氨氧化菌(AOB)和AnAOB等不同菌種的協(xié)同脫氮，故R2和R3反應器獲得了更高的氮去除率。在第8d和第10d時，R2和R3反應器內的NH4+-N和NO2--N同步去除率均達到90%以上，系統(tǒng)開始出現ANAMMOX反應，TIN去除率分別達82.25%和80.92%，R2反應器的脫氮性能略優(yōu)于R3反應器。江宇勤等的研究指出生物膜的質量會受到載體的比表面積、生物親和性和表面粗糙度等理化性質的影響。相比于K3填料，彗星纖維填料具有更大的比表面積，且表面親和性更強，有利于微生物附著，故R2反應器的脫氮性能更佳。

第Ⅱ階段(11~15d)，考慮到恢復初期反應器運行效果不穩(wěn)定，易因為氮負荷的過大波動而造成基質濃度抑制現象，第Ⅱ階段對進水基質濃度進行了小幅提升， ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分別提高到80mg·L-1和105.6mg·L-1.圖4(e)顯示，該階段未添加填料的R1反應器的化學計量比與理論值相差最大，且波動最為明顯，原因系R1反應器中的AnAOB活性仍較低，尚未占據主導地位。

2.2.2 負荷提高和穩(wěn)定運行階段

隨著ANAMMOX污泥脫氮性能的逐漸恢復，第Ⅲ階段(16~25d)，進水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分別調整為200mg·L-1和264mg·L-1，水力停留時間HRT為24h。圖4(a)和圖4(b)顯示，氮負荷的大幅提高使3組反應器的氮去除效果均受到影響而降低，但與R1相比，R2和R3反應器受到的波動要小得多，添加填料的ANAMMOX反應器具有更強的生態(tài)穩(wěn)定性和耐沖擊負荷能力。

為了進一步考察3組ANAMMOX反應器的脫氮穩(wěn)定性，第Ⅳ階段(26~42d)，進水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)進一步提高到300mg·L-1和396mg·L-1。由圖4(d)和圖4(e)可知，與前幾個階段相比，第Ⅳ階段中3組反應器的TIN去除率波動幅度明顯減小，化學計量比逐漸趨近理論值(NO2--N/NH4+-N等于1.32，NO3--N/NH4+-N等于0.26)，ANAMMOX系統(tǒng)開始進入穩(wěn)定運行階段。3組反應器經過42d的運行，脫氮性能均得到有效提升，TIN去除率分別達78.96%、84.92%和84.66%，NO2--N/NH4+-N分別為1.43、1.35和1.34，略高于理論值1.32，NO3--N/NH4+-N分別為0.21、0.24和0.23，略低于理論值0.26.王賢等的研究指出，不同反應裝置的化學計量比往往因為反應器類型、菌種的結構和狀態(tài)，所處環(huán)境條件不同而存在差異。一個良好的ANAMMOX系統(tǒng)往往是多菌種共同協(xié)作的脫氮過程，本實驗除了存在氨氧化菌(AOB)將NH4+-N轉化成NO2--N外，還存在部分反硝化菌將NO3--N轉化為NO2--N，使系統(tǒng)出現NO3--N/NH4+-N略低于理論值，而NO2--N/NH4+-N略高于理論值的現象。結果顯示，R2和R3反應器的TIN去除率顯著優(yōu)于R1反應器，在長期室溫儲存的ANAMMOX污泥的活性恢復過程中，填料可以為微生物提供更加穩(wěn)定的生長環(huán)境，增強ANAMMOX污泥抵抗不利環(huán)境的能力，提高ANAMMOX系統(tǒng)的脫氮穩(wěn)定性。

2.3 微生物群落特征分析

2.3.1 門分類水平上菌群結構分析

圖5所示的是3組反應器在門水平上的微生物群落結構，優(yōu)勢菌門(相對豐度>5%)為Proteobacteria(變形菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)和Patescibacteria。AnAOB是化能自養(yǎng)型細菌，目前發(fā)現的AnAOB均屬于浮霉菌門，R1、R2和R3反應器中的浮霉菌門占比分別為3.79%、8.71%和8.86%。劉冰等的研究發(fā)現填料的理化特性可顯著影響脫氮功能菌(尤其是AnAOB)的富集效果及活性，添加填料的R2和R3反應器獲得了更高的浮霉菌門豐度。

此外，在3組反應器中，變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)均占據了很大的比例(圖6)，這與多數研究中的厭氧氨氧化系統(tǒng)菌群分布相一致。變形菌門與脫氮過程密切相關，在厭氧氨氧化系統(tǒng)中廣泛存在，包括氨氧化細菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化菌(NOB)在內的多種微生物都屬于變形菌門，參與脫氮及許多污染物的降解過程。綠彎菌門常在自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)中被發(fā)現，是起骨架和載體作用的重要伴生功能菌，在ANAMMOX系統(tǒng)中扮演著重要角色。

2.3.2 屬分類水平上菌群結構分析

考察3組反應器在屬水平上的微生物群落結構，并進行分析，不同ANAMMOX反應器中的AnAOB豐度及其在浮霉菌門中的占比見表2.熱圖可以通過可視化的方法直觀地反映微生物的群落組成，污泥樣品中相對豐度排名前25的屬的分布熱圖見圖7.測序結果表明，污泥樣品中典型的ANAMMOX菌屬為CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia，其中， CandidatusJettenia在3組反應器中的相對豐度分別為1.62%、5.74%和5.21%，其在R2反應器中的相對豐度最高，其次是R3反應器，添加填料的兩組反應器中的CandidatusJettenia的相對豐度是空白對照組的3~4倍。 CandidatusBrocadia在3組反應器中的相對豐度均較低，分別為0.57%、1.11%和0.85%。總體來看，R1、R2和R3反應器中的AnAOB在浮霉菌門中的占比分別為57.78%、78.65%和68.40%。可以發(fā)現，填料的加入促進了AnAOB在浮霉菌門中占據主導地位，使優(yōu)勢菌屬更為凸顯。

2.4 厭氧氨氧化生物膜生長和顆粒污泥形成機制

一個良好的ANAMMOX系統(tǒng)中氮的去除往往是以AnAOB為主導功能菌，多種脫氮細菌綜合作用的結果，好氧菌和異養(yǎng)菌為AnAOB提供了基質和生存環(huán)境。R2和R3反應器中的ANAMMOX生物膜如圖8所示。

R2和R3反應器中的顆粒污泥主要是通過生物膜分離形成的，可能的顆粒化過程如圖9所示。生物膜的形成是一個動態(tài)的過程，包括初始生物量的積累(微生物附著)、發(fā)育(生長)和末端生物量的積累(成熟)。最初，懸浮污泥首先吸附在填料上，逐漸生長形成生物膜，這時的生物膜主要由好氧氨氧化菌(AOB)和異養(yǎng)反硝化菌(DEN)組成。待好氧菌把氧氣消耗后，生物膜內部出現缺氧區(qū)，為AnAOB的生存提供了有利條件，生物膜上的AnAOB數量逐漸增多。

胞外聚合物(EPS)是形成生物膜的重要條件，李鴻江等的研究發(fā)現AnAOB分泌的胞外聚合物含量要高于AOB，故其在填料上的掛膜效果顯著優(yōu)于AOB。因此，在良好的生存環(huán)境下，AnAOB利用氮素實現自身新陳代謝和生長繁殖，菌體數量得以增長，逐漸在填料上形成一層ANAMMOX生物膜并變厚。在機械振蕩和水力剪切作用下，部分厭氧氨氧化聚集體從過厚的生物膜外側分離出來，逐漸形成顆粒污泥，進行菌體的分裂繁殖，實現CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia數量的成倍增長，生物膜上的AnAOB的相對豐度是空白對照組的2~4倍。

3、結論

(1)投加填料構建厭氧氨氧化生物膜-顆粒污泥復合系統(tǒng)，可以有效提高室溫下儲存9個月的ANAMMOX污泥的活性恢復速率，投加填料的2組ANAMMOX反應器的AnAOB相對豐度是空白對照組的2~4倍，填料有效提高了反應器中的AnAOB的相對豐度，且彗星纖維填料的促進作用略優(yōu)于K3填料。

(2)在厭氧氨氧化污泥的活性恢復過程中，填料可以提高ANAMMOX污泥的耐沖擊負荷能力，提高系統(tǒng)的生態(tài)穩(wěn)定性和脫氮穩(wěn)定性。