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抗生素的過(guò)度使用給城市水環(huán)境帶來(lái)了很多潛在問(wèn)題，尤其是抗性菌和抗性基因的傳播，將會(huì)對(duì)人類(lèi)的健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。市政污水處理廠(chǎng)、制藥廠(chǎng)和醫(yī)院的水處理設(shè)施都存在不同濃度的各種抗生素殘留，據(jù)報(bào)道，在醫(yī)院廢水中檢測(cè)出的環(huán)丙沙星濃度為125μg/L、土霉素濃度為2.2mg/L、磺胺甲惡唑濃度為1.3mg/L。在兩座城市污水處理廠(chǎng)的二級(jí)出水中也檢測(cè)出濃度為3.6~1176ng/L不等的磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。存在于環(huán)境中的低濃度抗生素會(huì)導(dǎo)致耐藥性菌和耐藥性基因的出現(xiàn)和傳播。

四環(huán)素類(lèi)抗生素作為典型的抗生素，在養(yǎng)殖場(chǎng)廢水中經(jīng)常被檢測(cè)到且濃度相對(duì)較高，甚至達(dá)到388μg/L。并且，四環(huán)素廢水具有難處理的特點(diǎn)，如果處理不當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致具有四環(huán)素抗性的微生物帶來(lái)的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)。為此，以土霉素（OTC）、金霉素（CTC）、四環(huán)素（TC）作為四環(huán)素類(lèi)抗生素的代表性藥物，考察曝氣生物濾池（BAF）對(duì)污水中抗生素的深度去除效果。

BAF工藝常用于污水處理，對(duì)難降解污染物具有良好的去除效果。探究了不同水力停留時(shí)間（HRT）、不同抗生素濃度條件下BAF對(duì)四環(huán)素廢水中污染物的去除特性。同時(shí)，通過(guò)分析BAF生物膜中微生物群落結(jié)構(gòu)，探究不同抗生素濃度、不同水力停留時(shí)間下反應(yīng)器中微生物種群的演替規(guī)律。

1、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

曝氣生物濾池采用上部進(jìn)水的方式，水緩慢經(jīng)過(guò)濾料層和承托層，由底部流量計(jì)控制出水，如圖1所示。共制作了兩組高為200cm、內(nèi)徑為5cm的下向流BAF反應(yīng)器，分別記作1#和2#。反應(yīng)器采用陶粒填料，粒徑為3~5mm，填裝高度為1m。底部采用曝氣泵曝氣，控制溶解氧（DO）在4~6mg/L，通過(guò)改變進(jìn)水流量控制不同的水力停留時(shí)間，采用標(biāo)準(zhǔn)方法采集裝置進(jìn)水和出水。BAF采用氣、水聯(lián)合反沖洗，反沖洗周期根據(jù)運(yùn)行階段的不同控制在3~10d。

1.2 原水水質(zhì)及分析方法

模擬某制藥廠(chǎng)抗生素廢水二級(jí)生化處理單元出水，COD為40~90mg/L，氨氮為5~10mg/L。反應(yīng)器掛膜所用污泥取自天津市某污水處理廠(chǎng)沉淀池，采用快速接種法啟動(dòng)。

1#反應(yīng)器馴化20d穩(wěn)定運(yùn)行后，分為五個(gè)階段運(yùn)行，進(jìn)水抗生素濃度均控制在200μg/L，每個(gè)階段的HRT依次為1、3、5、10、20h，每階段運(yùn)行25d。2#反應(yīng)器分三個(gè)階段運(yùn)行，水力停留時(shí)間均為10h，各階段的抗生素濃度依次為200、600、1000μg/L，每階段運(yùn)行25d，分別考察不同階段的處理效果。

COD、氨氮、TP等采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，使用便攜式溶氧儀（JPB-607A）測(cè)定DO。土霉素、金霉素、四環(huán)素采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定，C18色譜柱，測(cè)定條件：進(jìn)樣量為100μL，柱溫為30℃，流動(dòng)相為甲酸/乙腈（20∶80），檢測(cè)波長(zhǎng)為355nm，流速為1mL/min，OTC、CTC、TC出峰時(shí)間分別為3.01、3.23、3.69min。

1.3 微生物群落分析

在不同時(shí)間段取微生物樣品3個(gè)，分別為樣品Ⅰ：1#濾柱未投加抗生素、HRT為1h且穩(wěn)定運(yùn)行后第25天的生物膜樣品；樣品Ⅱ：1#濾柱投加3種200μg/L四環(huán)素類(lèi)抗生素、HRT為1h而且穩(wěn)定運(yùn)行后第25天的生物膜樣品；樣品Ⅲ：1#濾柱投加3種200μg/L四環(huán)素類(lèi)抗生素、HRT為10h且穩(wěn)定運(yùn)行后第25天的生物膜樣品。

采集的樣品由生物工程（上海）股份有限公司檢測(cè)。使用E.Z.N.A?Mag-BindSoilDNAKit試劑盒進(jìn)行DNA的提取。利用Qubit3.0DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)DNA精確定量，用引物341F（5'-CCTAC?GGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTACH?VGGGTATCTAATCC-3'）擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因的V3-V4區(qū)，PCR實(shí)驗(yàn)條件參考文獻(xiàn)。PCR產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在IlluminaMiSeq平臺(tái)上測(cè)序。

2、結(jié)果與討論

2.1 HRT對(duì)COD、氨氮去除效果的影響

1#反應(yīng)器經(jīng)過(guò)20d的馴化，穩(wěn)定運(yùn)行后同時(shí)加入濃度為200μg/L的CTC、OTC和TC，其間DO控制在（5±1）mg/L。不同階段BAF對(duì)COD、氨氮的去除效果如圖2所示。HRT作為BAF重要的運(yùn)行參數(shù)，直接影響反應(yīng)器內(nèi)生物膜生長(zhǎng)和出水效果，不同HRT條件下污染物去除率有明顯差異。總體上COD去除率隨HRT的延長(zhǎng)而增加。當(dāng)HRT延長(zhǎng)時(shí)，濾池中水流速度相對(duì)緩慢，濾料充分發(fā)揮了截留作用，污染物與濾池中的微生物得到充分接觸而被去除。如圖2（a）所示，當(dāng)HRT從3h增加到20h，COD去除效果持續(xù)提升，去除率最大可達(dá)88%。抗生素投加初期對(duì)COD的去除產(chǎn)生影響，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的恢復(fù)后，隨著HRT的增加，COD去除效果逐漸增加。在HRT從1h增加到3h階段，COD去除率有減小的趨勢(shì)。可能是因?yàn)榭股氐募尤雽?duì)生物膜產(chǎn)生影響，沒(méi)有得到完全恢復(fù)。

從圖2（b）可以看出，在初期氨氮去除率受到抗生素投加的影響有所波動(dòng)，因?yàn)榭赡苁窍趸?xì)菌對(duì)抗生素比較敏感，導(dǎo)致硝化效果受到影響。隨著HRT的增加，氨氮去除率增加相對(duì)明顯，當(dāng)HRT從10h增加到20h時(shí)，氨氮去除率增加趨于平緩。氨氮整體去除率在97%~99%左右，表明BAF的硝化性能很好。由于BAF運(yùn)行到第四階段時(shí)，COD和氨氮去除率已達(dá)到較高水平，所以后期實(shí)驗(yàn)BAF的HRT均控制為10h。

2.2 BAF對(duì)抗生素的去除效果

2.2.1 HRT對(duì)去除效果的影響

第一階段出水CTC、OTC和TC濃度在20d左右達(dá)到穩(wěn)定，濃度分別為95、75和80μg/L，去除率分別為48%、62.5%和60%。HRT對(duì)抗生素的去除率有著顯著影響，延長(zhǎng)HRT能夠明顯提高對(duì)抗生素的去除效果（見(jiàn)圖3）。在第二和第三階段，OTC和TC去除率增加，分別為75%和78%，HRT對(duì)CTC的去除率影響大于OTC和TC，在HRT為5h時(shí)，CTC去除率就達(dá)到了99%以上。持續(xù)加大HRT，OTC和TC去除率最高分別可以達(dá)到85%和82.5%。總體來(lái)講，BAF對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素有較好的去除效果，增加HRT可以明顯提高BAF的去除率。Casas等人證明在慢速生物濾池中，污染物去除效率取決于HRT，HRT最長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)對(duì)多種抗生素都具有很高的去除率。

2.2.2 對(duì)不同濃度抗生素的去除效果

四環(huán)素類(lèi)抗生素的生物降解效果較差，且對(duì)微生物具有抑制作用，隨著濃度的增加，在HRT為10h條件下，2#反應(yīng)器對(duì)CTC、OTC、TC的去除率見(jiàn)圖4。

從圖4可以看出，隨著進(jìn)水抗生素濃度的不斷增加，BAF對(duì)CTC的去除效果仍能保持穩(wěn)定，去除率一直保持在99%以上；而對(duì)OTC和TC的去除率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，在濃度為200、600和1000μg/L時(shí)，BAF對(duì)OTC的平均去除率分別為80%、92%和95%，對(duì)TC的平均去除率分別為85%、93%和95%。在生物濾柱中抗生素可以通過(guò)光解、水解、吸附和生物降解去除，有研究顯示，污水中的四環(huán)素類(lèi)抗生素主要依靠吸附得到有效去除，生物降解比較緩慢。也有研究表明，在反應(yīng)器中TC主要通過(guò)生物降解作用去除，而生物吸附對(duì)去除TC的貢獻(xiàn)不顯著。雖然對(duì)于生物濾柱中抗生素的主要去除途徑?jīng)]有統(tǒng)一的定論，但是在生物濾柱中大多數(shù)抗生素都會(huì)被微生物不同程度地降解。本實(shí)驗(yàn)中在其他條件不變的情況下，提高進(jìn)水抗生素濃度至1000μg/L，抗生素的去除率在95%以上，可能長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)行導(dǎo)致生物膜中耐藥微生物的生長(zhǎng)，提高了系統(tǒng)對(duì)抗生素的降解能力。

在逐步提高進(jìn)水抗生素濃度的過(guò)程中，COD和氨氮的去除在初期都受到不同程度的沖擊，去除率都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但是經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的恢復(fù)后，去除效果會(huì)有所恢復(fù)和提升（見(jiàn)圖5）。在抗生素濃度為1000μg/L左右時(shí)，BAF對(duì)氨氮、COD的去除率分別為98%和82%左右，表明濾柱中的菌群結(jié)構(gòu)受到了抗生素的沖擊，但是經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后會(huì)有所恢復(fù)，但整體上去除率隨抗生素濃度的增加均呈下降趨勢(shì)。為了能進(jìn)一步解釋微生物的降解作用，對(duì)濾柱中的菌群演替規(guī)律做了進(jìn)一步的分析。

2.3 微生物菌群演替規(guī)律

2.3.1 物種多樣性及豐度指數(shù)分析

首先對(duì)高通量測(cè)序序列進(jìn)行OTU劃分，對(duì)97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)。在生態(tài)學(xué)中Chao1指數(shù)常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)，Ace指數(shù)用來(lái)估計(jì)種群中OTU數(shù)目，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)都用來(lái)估計(jì)樣品中微生物多樣性，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)中Coverage均大于0.998，反映了本次測(cè)序結(jié)果可以代表樣本的真實(shí)情況。

由表1可知，進(jìn)水投加200μg/L抗生素以后樣品的OTU指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)均有不同程度的下降，而Simpson指數(shù)提高，這說(shuō)明抗生素的加入對(duì)BAF中的微生物影響較大，抑制作用明顯，致使微生物群落的豐富度和多樣性下降。但是對(duì)比樣品Ⅱ、Ⅲ可以發(fā)現(xiàn)，延長(zhǎng)HRT以后樣品的OTU指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)都略有提高，說(shuō)明延長(zhǎng)HRT條件下微生物多樣性略有增加。而Simpson指數(shù)顯著降低，也同時(shí)說(shuō)明了BAF中微生物群落優(yōu)勢(shì)度在減小，多樣性在增加，但微生物群落豐富度變化并不明顯。所以較長(zhǎng)的HRT，更有利于BAF中各種微生物適應(yīng)抗生素的沖擊。

2.3.2 群落結(jié)構(gòu)組成演替規(guī)律分析

選取樣本中相對(duì)豐度大于1%的門(mén)做門(mén)水平種群分類(lèi)，共篩選出8個(gè)菌群，結(jié)果如圖6所示。在添加3種四環(huán)素類(lèi)抗生素后，微生物群落在門(mén)水平上產(chǎn)生的變化較大，門(mén)種類(lèi)降低。其中Proteobacteria（變形菌門(mén)）和Bacteroidetes（擬桿菌門(mén)）在添加抗生素前后均為優(yōu)勢(shì)菌群，且相較于添加抗生素之前，Proteobacteria豐度顯著升高，由43.63%分別升高為75.55%和77.34%。大量研究表明，Proteobacteria菌群在很多難降解污染物的降解過(guò)程中都起到了重要作用，Proteobacteria菌群是BAF具備較好的污染物去除效果及較高的四環(huán)素類(lèi)抗生素去除率的關(guān)鍵。Bacteroidetes豐度也有所上升，由11.01%升至18.34%和14.04%。研究表明，Proteobacteria和Bacteroidetes是脫氮系統(tǒng)中兩種關(guān)鍵異養(yǎng)菌群，在好氧生物處理系統(tǒng)中普遍存在。添加抗生素之后Planctomycetes（浮霉菌門(mén)）豐度由14.94%分別下降為0.34%和0.35%；Acidobacteria（酸桿菌門(mén)）豐度由12.72%分別降為0.02%和0.05%，說(shuō)明3種四環(huán)素類(lèi)抗生素抑制了曝氣生物濾池中Planctomycetes和Acidobacteria的生長(zhǎng)。此外，Actinobacteria（放線(xiàn)菌門(mén)）在三個(gè)樣品中豐度分別為3.63%、4.12%和0.46%，其豐度受HRT影響較大，HRT延長(zhǎng)到10h導(dǎo)致進(jìn)水負(fù)荷降低是Actinobacteria豐度下降的主要原因。

選取相對(duì)豐度大于1%的綱做種群分析，共篩選出10個(gè)菌群。與大多數(shù)好氧反應(yīng)器中的菌群研究相同，在Proteobacteria門(mén)中Gammaproteobacteria（γ-變形桿菌綱）、Alphaproteobacteria（α-變形桿菌綱）和Betaproteobacteria（β-變形桿菌綱）為主要的優(yōu)勢(shì)菌群。在四環(huán)素類(lèi)抗生素作用下，系統(tǒng)中Proteobacteria門(mén)相對(duì)豐度增加主要是由β-變形桿菌綱增加引起的。在本實(shí)驗(yàn)中，β-變形桿菌綱豐度由添加抗生素之前的2.23%上升至45.04%和35.74%，其豐度的顯著增加可能與它們獲得抗生素耐藥基因擁有耐藥性有關(guān)。β-變形桿菌綱中的菌群可以適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境，在抗生素廢水處理中經(jīng)常被檢測(cè)到。Alphaproteobacteria豐度由添加抗生素之前的15.22%上升至28.28%和27.77%，α-變形桿菌綱與β-變形桿菌綱相似，可能在含有抗生素的環(huán)境中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。γ-變形桿菌綱豐度由添加之前的24.57%下降至2.18%和13.79%。γ-變形桿菌綱豐度變化與其他菌群不同，在不同的HRT條件下其豐度存在差異，因?yàn)镠RT的延長(zhǎng)，降低了抗生素的負(fù)荷，在低抗生素負(fù)荷下其豐度有所恢復(fù)，說(shuō)明在Proteobacteria門(mén)中γ-變形桿菌綱似乎比α-變形桿菌綱和β-變形桿菌綱對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素負(fù)荷更敏感。另外，Bacteroidetes門(mén)中Flavobacteriia（黃桿菌綱）和Sphingobacteriia（鞘脂桿菌綱）在加入抗生素后豐度變化明顯。

選取菌群中含量變化較大的屬做種群分類(lèi)，結(jié)果如圖7所示。樣品Ⅰ中屬水平微生物菌群豐富，其中Enterobacter（腸桿菌屬）的豐度最高達(dá)到12.76%，在好氧生物工藝中Enterobacter是一種異養(yǎng)硝化細(xì)菌，具有高效硝化作用，但是由于抗生素的加入，大大抑制了Enterobacter的生長(zhǎng)，在樣品Ⅱ和樣品Ⅲ中幾乎沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明此類(lèi)菌屬對(duì)抗生素較為敏感。另外，unclassifiedPlanctomycetaceae和unclassifiedAcidobacteriaGp4這兩種普遍存在于污水生物處理系統(tǒng)中的專(zhuān)性好氧菌屬也受到了抗生素的抑制。這也可以解釋為什么抗生素加入后系統(tǒng)對(duì)氨氮和COD的去除率均出現(xiàn)了下降的現(xiàn)象。值得關(guān)注的是，在樣品中許多菌屬并未受到抗生素加入的影響。添加抗生素之后樣品Ⅱ和樣品Ⅲ中Acidovorax（嗜酸菌屬）是最優(yōu)勢(shì)的菌屬，相對(duì)豐度分別為43.88%和21.98%，Acidovorax在抗生素廢水處理中發(fā)揮重要的作用，參與某些抗生素的降解過(guò)程；unclassifiedRhizobiaceae（未分類(lèi)的根瘤菌屬）是Alphaproteobacteria綱中豐度最大的菌屬，有促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和生物膜形成的作用，此類(lèi)菌種在濾柱樣品中的豐度分別為3.58%、21.39%和17.65%，促進(jìn)了生物膜的形成，對(duì)污染物的去除起到了重要的作用。延長(zhǎng)HRT后，Gammaproteobacteria綱中的unclassifiedXanthomonadaceae（未分類(lèi)的黃單胞菌屬）豐度由1.70%升高至10.20%，其能夠利用碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，豐度增加有助于反應(yīng)器中有機(jī)物的去除；Betaproteobacteria綱中的Acidovorax豐度雖然有所降低，但仍為優(yōu)勢(shì)菌屬，同時(shí)Flavobacteriia綱中的Flavobacterium（黃桿菌屬）豐度由2.59%升高至12.07%，Chryseobacterium（金黃桿菌屬）豐度由15.61%下降至0.88%，F(xiàn)lavobacterium取代后者成為優(yōu)勢(shì)菌屬，F(xiàn)lavobacterium和Chryseobacterium兩種菌屬存在相似性，均具有降解有機(jī)物的作用，Chryseobacterium對(duì)有機(jī)物變化比Flavobacterium更加敏感，延長(zhǎng)HRT減少了單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入反應(yīng)器中有機(jī)物的數(shù)量從而促進(jìn)了這兩種菌群的更替。其中優(yōu)勢(shì)菌屬中Acidovorax、Flavobacterium均具有反硝化功能，總體上四環(huán)素類(lèi)抗生素的加入促進(jìn)了此類(lèi)具有反硝化作用的菌屬生長(zhǎng)。

3、結(jié)論

①在利用BAF處理抗生素廢水過(guò)程中，氨氮、COD的去除效果穩(wěn)定。四環(huán)素類(lèi)抗生素的去除率隨著水力停留時(shí)間的增加而提高，在進(jìn)水濃度為200μg/L、水力停留時(shí)間為10h時(shí)，四環(huán)素類(lèi)抗生素的去除率均在82.5%以上，其中CTC去除率在99%以上。

②逐步提高進(jìn)水抗生素濃度，BAF對(duì)氨氮、COD的去除率均略有降低，分別為98%、82%，對(duì)抗生素的去除率仍呈現(xiàn)提高的趨勢(shì)，抗生素濃度為1000μg/L時(shí)，濾柱對(duì)CTC的去除效果最好，達(dá)到99%，對(duì)OTC和TC去除率可以達(dá)到95%。

③投加抗生素后，BAF中微生物種群多樣性明顯降低。Proteobacteria（變形菌門(mén)）是主要的菌群且豐度變化最大；α-變形桿菌綱、黃桿菌綱和β-變形桿菌綱豐度顯著增加，這些菌群均可以適應(yīng)抗生素廢水；濾柱中一些常見(jiàn)菌屬受到抑制，其中包括具有硝化功能的菌屬Enterobacter（腸桿菌屬）在系統(tǒng)中完全被抑制，具有反硝化作用的Acidovorax（嗜酸菌屬）和Flavobacterium（黃桿菌屬）豐度顯著增加，在抗生素廢水處理中起到重要作用。